PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO Y RH DE LA FORMA DIRECTA

OBJETIVO:

Al finalizar la practica el alumno domine la técnica para la realización de la prueba para determinar grupos sanguíneos y Rh, empleando la técnica directa (con sangre total) utilizando los antisueros correspondientes para la determinación en el sistema ABO.

INTRODUCCIÓN:

Principio: en la membrana del glóbulo rojo existen complejos químicos llamados antígenos que representan los llamados grupos o factores sanguíneos. Se sabe que estos complejos químicos se han generado de una sustancia llamada precursora, llamada sustancia H (humana). Sobre esta sustancia se adhiere carbohidratos en un orden determinado. Para la sangre de tipo cero “0” se unen dos moléculas de galactosa, una de mucosa, una de glucosa y una de glucosalina.

Sobre esta cadena puede adherirse una nueva molécula y se cambia el tipo, si es de glucosalina se tiene del grupo A y si es de galactosa se tiene el grupo B. si se unen ambas moléculas en diversa posición se tiene el grupo AB.

Los primeros grupos sanguíneos que se descubrieron fueron los llamados ABO y actualmente se conocen muchos mas.

El sistema Rh es independiente del sistema ABO, pero igual de importante en la tipificación sanguínea.

Hay antígenos presentes en los eritrocitos de casi las personas y se les llama universales, otros antígenos se han concentrado en una sola familia y se les llama familiares y se han encontrado algunos otros que pertenecen solamente a un individuo y se les llama personales.

La importancia de la determinación de los grupos sanguíneos y Rh en el laboratorio es en las transfusiones sanguíneas y en la eritroblastosis fetal.

MATERIALES:

Pipeta pasteur

6 tubos de ensaye

Gradilla

Centrifuga

SUSTANCIAS:

Suero Anti-A

Suero Anti-B

Suero Anti-D

Solución isotónica al NaCl al 0.9%

PROCEDIMIENTO:

Método de tubo de ensaye:

1.     Previa asepsia, practicar venopuncion y recoger 1 ml de sangre

2.     Depositar en tubo se ensaye, 19 gotas de solución salina y una gota de eritrocitos para formar la suspensión de eritrocitos al 5 %.

3.     Marcar tres tubos con las letras A,B y Rh respectivamente, depositar en el tubo A dos gotas de suero Anti-A, el el tubo B dos gotas de Anti-B y en el tubo Rh dos gotas de suero y Anti-D.

4.     Añadir a cada tubo una gota de suspensión de eritrocitos al 5% (preparada con anterioridad).

5.     Centrifugar a 1000 r.p.m. durante dos minutos

6.     Sacar los tubos y observar inmediatamente la presencia de aglutinación.

RESULTADOS:

Método de tubo de ensaye:

ü Si existe aglutinación en el tubo “A” la sangre es de tipo “A”.

ü Si existe aglutinación en el tubo “B” la sangre es de tipo “B”.

ü Si existe aglutinación en los tubos “A” y “B” la sangre es de tipo “AB”.

ü Si no existe aglutinación en los tubos “A” y “B” la sangre es de tipo “O”.

ü  Si existe aglutinación en el tubo Rh la sangre será de factor Rh positivo.

ü Si no existe aglutinación en el tubo Rh la sangre será de factor Rh negativo.

RESULTADOS DE LAS MUESTRAS OBTENIDAS

Muestra: 1	Muestra: 2
Grupo: “A” Rh: Positivo	Grupo: B Rh: Positivo

TriniCLOT aPTT S

APLICACIÓN:

Es un equipo de prueba que se utiliza en la determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) y que consiste de un reactivo fosfolípido con activador en partículas y un reactivo de cloruro de calcio.

RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA:

La prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada es un procedimiento de screening universalmente aceptado que se utiliza para detectar anomalías en el sistema intrínseco de coagulación. Puede utilizarse también en pruebas de factores para detectar deficiencias de los factores II, V, VIII, IX, X, XI y XII, pero es insensible al factor plaquetario. Además puede utilizarse para detectar el anticoagulante de Lupus y se recomienda para controlar la terapia con heparina ya que es sensible a la presencia de esta. La prueba de TTPA no se recomienda para controlar la terapia  con anticoagulantes orales ni es sensible a la disfunción plaquetaria. Estas condiciones se controlan mejor mediante la prueba de tiempo de protrombina o una prueba de tiempo de sangrado, respectivamente.

El reactivo de TriniCLOT aptt s se mezcla con plasma del paciente para proporcionar una activación uniforme óptima de la muestra.

Después de la activación a 37°c durante 5 minutos se inicia la reacción añadiendo CaCi2 TriniCLOT aPTT S. se mide en segundos el tiempo necesario para la formación de coagulación.

MATERIALES:

1.       Micropipeta con puntas desechables 0.1 mL

2.      Plasmas control

3.      Plasma de referencia y plasma deficiente en factor (para pruebas de factores)

4.      Instrumentación para coagulación

5.      Micropipetas

6.      Plasmas de control triniCHECK

7.      Plasma de referencia triniCAL

8.     Plasmas deficientes en factores

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA:

1.       Calentar previamente a 37°c un volumen suficiente de reactivo TriniCLOT aPTT S y CaCi2 TriniCLOT aPPT S.

2.      Etiquetar un tubo de ensayo para cada muestra (paciente y control) a analizar.

3.      Pipetear 0.1 mL de muestra o control al tubo adecuado; a continuación, pipetear 0,1 mL de Reactivo TriniCLOT aptt s a cada tubo.

4.      Después de la activación pipetear inmediatamente a cada tubo 0.1 mL de CaCi2 TriniCLOT aPTT S previamente calentado e iniciar simultáneamente el cronometraje para la detección de la coagulación mediante un método de detección conveniente. Anotar el tiempo, en segundos, transcurrido hasta que se detecta coagulación.

NOTAS DEL PROCEDIMIENTO Y PRECAUCIONES:

1.       Al fin de obtener un funcionamiento adecuado del reactivo, debe utilizarse CaCi2 TriniCLOT aPPT S en combinación con Reactivo TriniCLOT aPPT S. No sustituir el CaCi2 TriniCLOT aPPT S por otros reactivos de cloruro de calcio. Los reactivos deben de corresponder específicamente con el lote de equipo para asegurar un funcionamiento óptimo. No mezclar los reactivos de diferentes lotes de quipo.

2.      Se recomienda efectuar las determinaciones por duplicado para los métodos manuales.

3.      Es importante utilizar material de vidrio (o de plástico) limpio. La superficie del contenedor y el área superficial pueden alterar la activación de las muestras. Se recomienda seguir una misma técnica en todos los procedimientos de coagulación.

4.      La siguiente secuencia es adecuada para realizar una prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada; para las determinaciones automáticas seguir las instrucciones específicas que acompañan al instrumento utilizado

RESULTADOS:

El tiempo obtenido (en segundos) es el tiempo de tromboplastina parcial  activada del  paciente.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

Aunque con TriniCLOT aPTT S pueden utilizarse casi todos los métodos manuales y automáticos para la detección de la coagulación, los diversos métodos pueden detectar puntos finales ligeramente distintos. Deben tomarse oportunas precauciones al comparar resultados obtenidos con métodos distintos.

El plasma de algunos pacientes con alto contenido en fibrinógeno muestra en aumento de turbiedad tras añadirle cloruro de calcio, lo que puede originar, antes de la formación real de coagulo, un registro del tiempo de coagulación al usarse un sistema óptico de detección. No obstante, el tiempo real de coagulación no queda afectado por ello, lo cual permite la obtención de un ttpa terapéuticamente  apropiado usando un método no óptico. Los plasmas cuyo resultado de punto final  de ttpa óptico es inferior a 22 segundos, con valores ampliamente discrepantes o incongruentes con el curso de la terapia del paciente, deberán ser identificados y controlados nuevamente con un sistema de detección de punto final no óptico.

RESULTADOS:

MUESTRA 1

12 SEGUNDOS

MUESTRA 2

16 SEGUNDOS

CONCLUSIÓN:

TriniCLOT Fibrinogeno.

El kit de TriniCLOT Fibrinogen está diseñado para la determinación cuantitativa del fibrinógeno en plasma.

RESUMEN:

La mayoría de los métodos para determinar la concentración de fibrinógeno asumen que la trombina convertirá cuantitativamente el fibrinógeno a fibrina. La estimación de la concentración en base al peso o contenido proteico del coágulo de fibrina formado puede estar sujeta a importantes errores debido a la presencia de inhibidores que provocarán la formación de coágulos pequeños o ausencia de coágulos. La plasmina también puede producir lisis significativa del coágulo formado antes de que pueda ser completada la determinación final de fibrinógeno. Se han descrito procedimientos alternos basados en la precipitación con sulfato de amonio5,6 pero estos no correlacionan con los tiempos de coagulación de la trombina cuando los niveles de fibrinógeno están por debajo de 100 mg/dl (1.0 g/L)

PREPARACION DEL REACTIVO:

Reconstituya el TriniCAL Fibrinogen con 1,0 ml de agua destilada o desionizada. Tape denuevo el vial y déjelo reposar hasta que esté completamente disuelto. Inviértalo suavemente para mezclarlo. NO LO AGITE. 

Reconstituya el reactivo de trombina con 6,0 ml de agua destilada o desionizada. Tape de nuevo vial y déjelo reposar hasta que esté completamente disuelto. Inviértalo periódicamente. NO LO AGITE.  El tampón de imidazol se suministra como un líquido y no requiere preparación antes de su uso.

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

Se deben seguir las precauciones normales establecidas para el manejo de reactivos en el laboratorio. Deseche los residuos de acuerdo con la legislación local, nacional y regional.

El TriniCAL Fibrinogen es un MATERIAL QUE PODRÍA SUPONER UN RIESGO BIOLÓGICO.

Métodos de prueba aprobados indican que los materiales originales de los que deriva este product muestran resultados negativos de AgHBs, así como anticuerpos contra el VHC, el VIH-1 y el VIH-2. Sin embargo, como no hay ningún método de prueba que pueda garantizar por completo que no existan agentes infecciosos, este producto deberá manejarse cumpliendo las mismas precauciones de seguridad que cuando se manipula material potencialmente infeccioso.  El reactivo de trombina es NOCIVO. Produce daños si entra en contacto con la piel o si se ingiere. Produce irritación en los ojos, en el sistema respiratorio y en la piel. En caso de contacto con los ojos, lávelos inmediatamente con abundante agua y consulte a un médico. Lleve ropa de protección adecuada. La ausencia de vacío al abrir un vial de reactivo de trombina o TriniCAL Fibrinogen, o la incapacidad para obtener valores reproducibles son posibles signos de deterioro del producto.

El tampón de imidazol contiene acida de sodio, que es NOCIVA. Produce daños si entra en contacto con la piel o si se ingiere. El contacto con ácidos libera un gas muy tóxico. Mantenga el contenedor herméticamente cerrado. Lleve ropa y guantes protectores adecuados. MATERIAL CON RIESGO BIOLÓGICO POTENCIAL. La acida de sodio puede reaccionar con piezas de plomo y cobre, dando como resultado acidas metálicas altamente explosivas. Evite la acumulación de acidas. Deseche el tampón de imidazol si hay signos de crecimiento microbiano.

Método de BBL Fibrometer:

Curva de calibración y prueba del plasma del paciente:

1. Reconstituya el reactivo de trombina y manténgalo a temperatura ambiente (18-25°C) durante la prueba.

2. Añada 0,2 ml (200 µl) de la muestra de plasma diluida a una copa de Fibrometer.

3. Incube durante 1–3 minutos a 37°C. (No más de 5 minutos.)

4. Después de la incubación, extraiga rápidamente 0,1 ml (100 µl) del reactivo de trombina en la copa de Fibrometer y, al mismo tiempo, active el cronómetro.

5. Anote los resultados del tiempo de coagulación en segundos.

6. Extrapole la concentración a partir de la curva de calibración.

Las sondas deben lavarse y secarse entre una prueba y otra para evitar el arrastre de proteínas plasmáticas activadas. Para una limpieza eficaz, las sondas de Fibrometer deben sumergirse en agua y frotarse CON FUERZA después de cada determinación. No basta con secarlas con papel secante.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

La dilución más baja recomendada de la prueba es 1:3. No se puede emplear plasma sin diluir, ya que los inhibidores y las sustancias que interfieren pueden afectar a la precisión de los resultados.

El tiempo de medición más corto para el instrumento KC 1/KC 4 es de unos 4,5 segundos. Cuando obtenga un tiempo de coagulación de 4,5 segundos, vuelva a ejecutar la muestra con una dilución diferente.

Los resultados no se ven excesivamente afectados por niveles terapéuticos de heparina habituales (hasta 3,0 USP U/ml) detectados en pacientes anticoagulados. Se ha indicado que los productos de degradación de la fibrin (PDF) pueden inhibir la acción de la trombina sobre el fibrinógeno y la polimerización de la fibrina. Los PDF tienen un efecto mínimo en un ensayo de fibrinógeno con niveles normales de fibrinógeno. En concentraciones de fibrinógeno por debajo de 150 mg/dl (1,5 g/L), una concentración de PDF superior a 100 g/ml puede inhibir en mayor medida el ensayo de Clauss.

RESULTADOS:

MUESTRA 1: 1 MINUTO

MUESTRA 2: 1 MINUTO, 7 SEGUNDOS.

PRUEBA DE DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO ABO DE LA FORMA INVERSA.

OBJETIVO. Al término de la práctica el alumno estará capacitado para comprobar indudablemente la tipificación sanguínea.

INTRODUCCIÓN. El suero del paciente que contiene anticuerpos en contacto con los eritrocitos que contienen antígenos formando un complejo AG-AC, que se manifiesta microscópicamente mediante una aglutinación.

MATERIAL.

1.     Pipetas pasteur.

2.    4 tubos de ensayo.

3.    Gradilla

4.    Centrifuga

SUSTANCIAS.

·         Eritrocitos lavados AYB conocidos.

·         Suero del paciente

PROCEDIMIENTO

PRUEBA A LA INVERSA.

1.     Se preparan suspensiones de glóbulos rojos al 25 de la siguiente forma, en un tubo de ensaye marcado con la letra A se pone una gota de sangre A y en otro marcado con la letra B s pone una gota de sangre B, se llenan los tubos con solución salina se centrifuga a 3400 R.P.M. durante 3 minutos y se decanta el líquido sobrenadante invirtiendo los tubos.

2.    A cada uno de los tubos se añade 1 cm de solución salina y se suspenden los glóbulos rojos.

3.    Se marcan dos tubos de ensaye, con la letra A y el segundo con la letra B, añadiendo dos gotas de suero.

4.    Añadir a cada tubo una gota de suspensión de eritrocitos al 2% (Preparada con anterioridad) previamente mezclada, al tubo A suspensión “A” y al tubo B suspensión “B”

5.    Centrifugar a 1000 RPM durante dos minutos.

6.    Sacar los tubos mezclando suavemente e interpretar resultados.

RESULTADO

PRUEBA INVERSA.

-          Si el suero problema aglutina a los glóbulos rojos A significa que tiene Ac´s B, el suero que tiene Ag-A corresponde a la sangre B, el suero problema corresponde a una sangre de grupo B.

-          Si el suero problema aglutina a los glóbulos rojos B significa que tiene Ac´s, el suero que tiene Ag-B corresponde a la sangre A, el suero problema corresponde a una sangre de grupo A.

-          Si el suero problema aglutina los glóbulos rojos A y B significa que tiene Ac´Sab, el suero que tiene Ac´s AB corresponde a la sangre O, en consecuencia el suero problema corresponde a una sangre del grupo O.

-          Si el suero problema no aglutina en los glóbulos rojos A y B significa que no tiene ac´s ni A ni B, por lo que tanto el suero problema pertenece a una sangre del grupo AB.

RESULTADOS.

-          Teresa De Jesús Reyes Martínez. SANGRE TIPO “B”.

-          Nallely Avilés Blancarte SANGRE TIPO “A”.

PRUEBA EN TIRA PARA LA DETECCION RAPIDA CUALITATIVA DEL ANTIGENO DE SUPERFICIE HEPATITIS B EN SUERO HUMANO

PRINCIPIO DE PRUEBA

La prueba Bio-HBsAg en tira está diseñada para la detección rápida cualitativa del Antígeno de Superficie Hepatitis B en suero humano.
EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA

La hepatitis B es una de las mayores causas de hepatitis en la población mundial. Las personas que son portadoras del virus pueden no tener el síndrome, pero pueden ser fuentes de infección.
Esta prueba está elaborada a partir de tecnología de inmunoensayo cromatrografico de flujo lateral conteniendo una membrana filtrante pre-impregnada con anticuerpos anti-HBsAg. En la prueba de tira existen dos regiones a lo largo de la membrana, la zona en donde se obtiene el Resultado, denominada región Test “T” y la región de control “C” donde se verifica que el desarrollo de la prueba haya sido satisfactorio.
En la región Test “T” aparecerá una línea de color rojiza como resultado de la presencia de HBsAg en la muestra evaluada. En caso contrario, no aparece ninguna línea en dicha región. En la región de control “C” siempre aparecerá una línea de color rojiza independientemente de un resultado positivo o negativo, como indicador interno de Control de Calidad de la prueba para verificar que esta se realizó adecuadamente.

REACTIVOS Y MATERIAL SUMINISTRADO

1.- Cada equipo de Bio-HBsAg contiene 25 tiras empacadas individualmente en un sobre con desecante como protección contra la humedad.
2.- Instructivo de uso.
RECOLECCION Y MANEJO DE LA MUESTRA
1.- Proceda a la toma de sangre utilizando procedimientos clínicos de rutina.
2.- Separa el suero por centrifugación. Las muestras podrán permanecer refrigeradas hasta por 3 días a temperaturas de entre 2-8 C.
3.-En caso de que no se utilice inmediatamente la muestra, se podrá congelar a -20` C o temperaturas inferiores para almacenajes prolongados.
4.- evite dañar la muestra congelada y regresada a temperatura ambiente en repetidas ocasiones.



PREPARACIÓN ANTES DE REALIZAR LA PRUEBA

1.- Mantengan el equipo a temperatura ambiente con 30 minutos de antelación a la realización de la prueba.
2.- Verifique la apariencia del suero evitando utilizarlo en caso de turbidez.
3.- Evite abrir el sobre metalizado conteniendo la prueba hasta el momento de utilización.
4.- Tenga listo un contenedor de residuos bio-peligrosos para desechar los desperdicios utilizados en la prueba.

DESARROLLO DE LA PRUEBA

1.- Saque la tira del sobre y colóquela en un área de trabajo adecuada.
2.- Codifique la tira utilizada para que coincida con los datos de la muestra del paciente.
3.- coloque suficiente suero en un micro-contenedor, recomendando la utilización de un recipiente plástico desechable de 10mm.
4.- Tome la tira e introduzca el extremo que tendrá contacto con el suero, teniendo precaución de que no se sumerja más allá de la línea delimitada por las flechas.
5.- resultados altamente positivos aparecerán a partir del 2do. O 3er. Minuto. Muestras positivas conteniendo una menor concentración de positividad podrán tardar hasta 15 minutos en aparecer. No interprete resultados después de trascurridos 30 minutos.
Limite profundamente el área de trabajo después de haber hecho las pruebas con hipoclorito de sodio o equivalente.

INTERPRETACION DE RESULTADOS

POSITIVO
La aparición de dos líneas rojizas (una en la zona del Test “T” y otra en la zona de Control “C”) sugieren que en la muestra evaluada hay presencia de HBsAg a niveles de por lo menos 1.5 ng/ml.

NEGATIVO
La presencia de únicamente una línea rojiza en la zona de control “C” sugiere que no hay existencia de HBsAg en la muestra evaluada y el resultado es NEGATIVO.
INVALIDO

Se invalidara la prueba en caso de que no aparezca ninguna línea en la Tira o en el caso de que únicamente aparezca laq línea de Test “T” sin que se confirme la aparición de la línea de control “C”.


CONTROL DE CALIDAD
Siempre lleve a cabo sus pruebas de Diagnóstico bajo un ambiente de estricto control de acuerdo a los preceptos establecidos por las autoridades sanitarias correspondientes.

RESULTADO
Negativo